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傳代細胞的傳代方法及操作過程

更新時間:2013-04-18      點擊次數:6881

傳代細胞的傳代方法及操作過程

實驗原理
    傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1:2或1:2以上的比例轉移,接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。
    這種培養(yǎng),*步也是制備細胞懸液,當細胞長成致密單層時,它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混合物,做為消化液。
    細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。要使細胞能在體外長期生長,必須滿足兩個基本要求:一是供給細胞存活所必需的條件,如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度,注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。
主要試劑
L磷酸鹽緩沖液(PBS)
無鈣、鎂溶液
細胞消化液:0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA
EMEM液
3%谷氨酰胺
0.5%臺盤藍染液等
主要設備
    解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須*清洗、烤干、包裝好,9.9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。
    此外,還有顯微鏡、血細胞計數器、血細胞計數板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標記筆、解剖板等。
實驗材料
喉癌細胞
實驗步驟
在做傳代細胞培養(yǎng)之前,首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下,觀察培養(yǎng)瓶中細胞是否已長成致密單層,如已長成單層,即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。
1. 營養(yǎng)液配制:
EMEM液                                90%
犢牛血清                                10%
雙抗(1萬單位/m1)                加至約100單位/m1
3%谷氛酞胺                           1m1
7.4%NaHCO3                         調pH至6.8—7.0
2. 換液:
在酒精燈旁打開瓶塞,倒去瓶中的細胞營養(yǎng)液。
3. 消化與分裝
    在上述瓶中加入1mlEDTA溶液,輕輕搖動,將溶液倒出。重復上述動作。加入適量消化液(0.02%EDTA或0.04%EDTA1ml加0.5%胰蛋白酶液0.2ml)以蓋滿細胞為宜,置于室溫,停留1—2min后,翻轉培養(yǎng)瓶,肉眼觀察細胞單層是否出現縫隙(針孔大小的空隙),如出現縫隙,即可倒去消化液;如末出現縫隙,則可將瓶翻回,繼續(xù)進行消化,直到出現縫隙為讓。此時,可倒去消化液,加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液,反復吹打瓶壁上的細胞層至瓶壁細胞全部脫落下來為止。此時,可繼續(xù)輕輕地吹打細胞懸液,以使細胞散開。隨之進行分裝。
4. 培養(yǎng)
    分裝好的細胞瓶上,做好標志,注明細胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上,輕搖使細胞均勻分布,以免堆積成團。然后置于37℃培養(yǎng)。
5. 觀察
   1) 觀察體外培養(yǎng)細胞的幾個問題;
細胞培養(yǎng)24h后,即可進行觀察,觀察的重點如下:
      a. 首先要觀察培養(yǎng)細胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度
      b. 觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細胞是否生長。
      c. 如細胞已生長,則要觀察細胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時可參照2)的描述進行。
      d. 觀察完畢,可用臺盤藍染液對細胞進行染色。以確定死、活細胞的比例。
   2) 細胞的生長階段及其形態(tài)特征
傳代培養(yǎng)的細胞需逐日進行觀察,注意細胞有無污染,培養(yǎng)液顏色的變化及細胞生長的情況。—般中層培養(yǎng)的細胞,從培養(yǎng)開始,經過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個連續(xù)的生長過程,但為了觀察及描述,人為地將具分為5個時期,但各期間無明顯界限。現分別描述如下:
      a. 游離期:當細胞經消化分散成單個細胞后,由于細胞原生質的收縮相表面張力以及細胞膜的彈性。所以,此時細胞多為圓形,折光率高,此期可延續(xù)數h。
      b. 吸附期(貼壁):由于細胞的附壁持性,細胞懸液靜置培養(yǎng)一段時間(約7—8h)后,便附著在瓶壁上(此期不同細胞所需時間不同)。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態(tài)的細胞,如圓形、扁形、短菱形。細胞的特點,大多立體感強,細胞內顆粒少,透明。
      c. 繁殖期:培養(yǎng)l2h以后直到72h,細胞進入繁殖期,加速了細胞生長和分裂。此期包括由幾個細胞形成的細胞島(即由少數細胞緊密聚集而呈現的孤立細胞群,常散在地分布在瓶壁上),到細胞鋪滿整個瓶壁(即所謂形成細胞單層)的過程。此期細胞形態(tài)為多角形(呈現上皮樣細胞的特征)。細胞特點:透明,顆粒較少,細胞間界限清楚,并可隱約見到細胞核。根據細胞所占瓶壁有效面積的百分率,又可將其生長狀況分為四級。以“十”的多少表示如下:
十:細胞占瓶壁有效面積(也就是細胞能生長的瓶壁面積)的25%以內有新生細胞。一般要觀察3—5個視野內的細胞生長狀況,然后加以綜合分析判斷。
十十:細胞占瓶壁有效面積的25—75%以內具新生細胞。
十十十:細胞占瓶壁有效面積的75—95%具新生細胞。細胞排列致密。但仍有空隙。
十十十十:細胞占瓶壁95%以上,細胞已長滿或接近長滿單層,細胞致密,透明度好。
從十十一十十十十為細胞的對數增長期(或稱為指數增長期)。
      d. 維持期:當細胞形成良好單層后,細胞的生長與分裂都減緩,并逐漸停止生長,這種現象被稱為細胞生長的接觸抑制。此時細胞界限逐漸模糊,細胞內顆粒逐漸增多,且透明度降低,立體感較差。由于代謝產物的不斷積累,維持液逐漸變酸。此時營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。
      e. 衰退期:由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長,以及代謝產物的累積等因素,此時細胞間可出現空隙,細胞中顆粒進一步增多,透明度更低,立體感很差。若將細胞經固定染色處理后,可見細胞中有大而多的脂肪滴及液泡。zui后,細胞皺縮,逐漸死亡,從瓶壁上脫落下來。

 

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